来自中国科学院化学研究所的研究团队，在《Angewandte Chemie International Edition》上发表了一篇题为“Nanopore-Based High-Resolution Detection of MultiplePost-Translational Modifications in Protein”的研究论文。该研究展示了通过主客体相互作用辅助的纳米孔传感策略，实现了对蛋白质中多种翻译后修饰（PTMs）的高分辨率检测。

1、引言

蛋白质翻译后修饰（PTM）是生物体内细胞过程的重要调控机制。这些修饰不仅扩展了蛋白质组的多样性，还深刻影响着蛋白质的功能和细胞命运。然而，由于缺乏可靠的、便捷且低成本的检测方法，许多PTM尚未在蛋白质组水平上得到深入研究。本文介绍了一种基于主客体相互作用辅助的纳米孔传感策略，用于检测短肽中的多种PTM。

2、研究背景与意义

PTM在生物体内广泛存在，并参与众多生理过程。例如，错误的PTM调节可能导致阿尔茨海默病、癌症和心脏病等疾病。因此，识别蛋白质及其PTM位点对于深入分析PTM通路至关重要。传统的方法如质谱法虽然有效，但存在信号噪声比低、某些类型的PTM易降解或改变等问题，限制了其应用范围。新的基于隧穿电流的方法可以在单分子水平上识别某些PTM，但底物范围仍然非常有限。

3、新型纳米孔传感策略

本研究提出了一种简单高效的纳米孔传感策略，通过α-溶血素纳米孔（αHL）结合葫芦[7]脲（CB[7]），实现了对13种不同类型的PTM以及20种天然氨基酸的明确区分。该方法利用特定位置上的苯丙氨酸残基进行修饰，当肽链穿过纳米孔时，产生的电流阻断现象可以精确地识别出各种PTM类型及其位置异构体。

实验设置和用于区分PTM位点的肽构建体示意图

此外，研究人员还将这一策略扩展到更复杂的多PTM检测中。通过将目标肽替换为含有最多16个氨基酸的短肽，成功地区分了多个PTM位点。实验表明，桶状结构能够敏感地识别至肽链第18位的PTM位点。

PTM检测在长肽上的示意图

4、实验结果与讨论

为了验证该方法的有效性，作者构建了一系列FGXD8探针，其中“X”代表被修饰或未被修饰的氨基酸。结果显示，在添加400 nM浓度的每种分析物后，所有数据均在pH 5.0、3.6 M KCl和10 mM柠檬酸缓冲液条件下获得，并保持+200 mV跨膜电位。通过对WT αHL和(M113F)7突变体αHL两种形式的比较，证实了这种方法能够准确区分13种不同的修饰氨基酸及20种原始氨基酸。

13种修饰氨基酸代表五类PTMs，包括甲基化、乙酰化、磺酸化、磷酸化和糖基化

进一步地，团队开发了一个机器学习算法来自动识别FGXD8探针中的PTM。经过特征提取和模型训练，最终选择了表现最佳的宽神经网络（WNN）模型，其验证准确率为87.9%，测试准确率为87.4%。尽管某些样本在三折交叉验证中表现出较低的区分精度，但在五折交叉验证下，整体性能得到了显著提升。

5、结论与展望

综上所述，这项工作展示了一种新颖而有效的纳米孔传感技术，可用于高分辨率地检测蛋白质中的多种翻译后修饰。随着技术的不断改进和完善，它有望成为替代传统质谱分析的强大工具，特别是在生物学相关样品中PTM检测方面具有广阔的应用前景。未来的研究将继续探索更多类型的PTM，并提高检测灵敏度和特异性，为理解复杂的生命过程提供强有力的支持。

本研究中，所有肽均由强耀生物合成。