结肠癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一。一些细胞毒性药物，如伊立替康、奥沙利铂和氟嘧啶类提高了晚期结肠癌患者的生存率。然而，全身副作用和耐药性限制了这些药物的临床应用。因此，迫切需要更有效的结肠癌治疗方法。

热休克蛋白90 (HSP90)是一种分子伴侣，在致癌蛋白的折叠和稳定中发挥关键作用，被广泛认为是治疗各种癌症的有希望的靶点。近年来，大量的HSP90抑制剂被发现，一些药物已经进入临床试验。然而，由于疗效有限，没有HSP90抑制剂被FDA批准。科学家们对HSP90及其抑制剂的研究并未停止。虽然单独使用HSP90抑制剂的治疗效果有限，但HSP90抑制剂与其他药物联合应用的前景值得关注。

控制癌细胞中的ROS水平可能是杀死癌细胞的有效策略。给癌细胞注射HSP90抑制剂会削弱它们应对压力的能力，因此与其他ROS诱导剂联合使用有可能达到更好的治疗效果。10月13日，温州医科大学研究人员在国际期刊Cell Death Discovery上发表了相关研究，论文题目为：Combination therapy with HSP90 inhibitors and piperlongumine promotes ROS-mediated ER stress in colon cancer cells。研究发现HSP90抑制剂与荜茇酰胺（PL）联合治疗在结肠癌细胞中表现出强烈的协同作用，并通过促进内质网（ER）应激、JNK激活和DNA损伤发挥协同作用，这个过程是由活性氧积累引起的氧化应激推动的。

PL和HSP90抑制剂17-AAG抗肿瘤作用图

研究结果

1. PL与HSP90抑制剂联合使用协同抑制癌细胞生长

HSP90抑制剂17-AAG和ganetespib以剂量依赖性方式降低结肠癌细胞的活力。当HSP90抑制剂与PL联合使用时，生长抑制作用更为明显；进一步分析表明HSP90抑制剂与PL有协同作用（17-AAG与PL的协同作用优于ganetespib）；进一步评估了17-AAG与PL联合对结肠癌细胞集落形成能力的影响，结果如图1所示，17-AAG与PL联合使用导致菌落数量显著下降。

图1 PL与HSP90抑制剂的组合可抑制细胞增殖

2.PL与17-AAG组合可增加结肠癌细胞中ROS的产生并导致DNA损伤

ROS的过度积累会导致DNA氧化损伤，导致细胞死亡。研究发现PL与17-AAG结合时，ROS水平会显著升高，彗星尾巴的长度增加（彗尾的长度与DNA损伤的程度呈正相关），结肠癌细胞核γ-H_2AX和53BP1（DNA损伤相关指标）聚集点明显增加，表明了PL与17-AAG联合使用导致DNA损伤严重。

图2 PL与17-AAG的组合增加了ROS的产生并诱导DNA损伤

3. ROS清除剂解决了联合治疗引起的DNA损伤和细胞活力抑制

在PL与17-AAG联合治疗前，研究团队用ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）预处理细胞。结果发现，结肠癌细胞中细胞内ROS水平的积累、细胞尾现象和γ-H2AX或53BP1在细胞核中的聚集点明显降低；更重要的是，NAC消除了联合治疗对细胞毒性和集落形成能力抑制的协同作用；进一步研究联合处理导致细胞死亡的机制，研究发现pancaspase途径抑制剂Z-VAD-FMK（细胞死亡途径的抑制剂）显著逆转了联合治疗引起的细胞死亡（见图3）；结果表明17-AAG和PL之间的协同作用需要ROS的积累，这种作用可能是通过诱导细胞凋亡而导致细胞死亡的。

图3 ROS清除剂逆转了联合治疗抑制的细胞活力

4. PL和17-AAG组合激活JNK信号通路

17-AAG与PL联合使用显著增加了结肠癌细胞中p-JNK的表达。为了确定JNK是否与17-AAG和PL之间的协同作用有关，研究用JNK的特异性抑制剂SP600125来阻断JNK的活性，研究发现，SP600125预处理后，可显著抑制细胞中p-JNK表达，阻断了17-AAG和PL在细胞生长抑制方面的协同作用，表明JNK途径的激活对于17-AAG和PL之间的协同作用至关重要。此外，NAC预处理显著阻断了JNK通路的激活，表明JNK是ROS介导的细胞死亡的下游效应器。

图4 PL与17-AAG组合激活JNK信号通路

5. PL和17-AAG协同诱导结肠癌细胞内质网应激

特定抑制剂对HSP90的抑制会引发各种癌细胞中的内质网（ER）应激。研究显示，联合治疗后结肠癌细胞中GRP78、ATF4和CHOP的表达增加，其中后两种表达增加显著；CHOP积累集中在细胞核中，使用慢病毒系统敲低了CHOP表达，结果发现显著逆转了17-AAG和PL在细胞生长抑制方面的协同作用，表明CHOP对于协同作用至关重要。

过多的ROS积累会导致氧化应激并引发内质网应激。为了探究联合处理的细胞中ROS和ER应激之间是否存在可能的联系，研究通过预处理NAC以阻止ROS生成。研究检测到ATF4 CHOP表达显著降低，CHOP在细胞核中的积累减少，表明了ROS积累可以引发ER应激和CHOP依赖性细胞死亡。

图5. PL和17-AAG协同诱导结肠癌细胞内质网应激

6. PL和17-AAG协同抑制体内结肠癌细胞的生长

最后，研究人员探究了PL和17-AAG联合使用对体内肿瘤生长的影响。结果显示，联合使用比单独治疗更能减少肿瘤生长，联合治疗未引起任何显著毒性；丙二醛MDA水平明显升高（氧化应激标志物），JNK磷酸化以及ATF4和CHOP的表达增加。这些结果表明17-AAG和PL的联合使用是一种有前景的结肠癌治疗方法。

图6. PL和17-AAG协同抑制体内结肠癌细胞的生长

总之，PL可以通过诱导ROS生成来增强HSP90抑制剂的抗肿瘤功效。该研究提供了一种将HSP90抑制剂与现有ROS诱导剂或物理治疗相结合的有用策略，发现了一种新的结肠癌治疗组合。然而，为了为该组合在临床治疗中的使用提供坚实的理论基础，需要证实更详细的体内药代动力学。

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